Renovatio 21 traduce questo articolo per gentile concessione di Children’s Health Defense. Le opinioni degli articoli pubblicati non coincidono necessariamente con quelle di Renovatio 21.
Secondo un team di ricercatori e medici del programma di ricerca clinica ImmuGene dell’Università di Zurigo in Svizzera, in determinate condizioni l’editing genetico basato su CRISPR può portare a delezioni e riarrangiamenti del DNA su larga scala.
Sono in fase di sviluppo strumenti di editing genetico basati su CRISPR per correggere specifiche sezioni difettose del genoma e curare malattie genetiche ereditarie; alcune applicazioni sono già in fase di sperimentazione clinica.
Tuttavia, c’è un problema: in determinate condizioni, la riparazione può portare a delezioni e riarrangiamenti su larga scala del DNA, come nel caso del targeting del gene NCF1 nella malattia granulomatosa cronica (CGD). Questo è stato segnalato da un team di ricercatori e medici del programma di ricerca clinica ImmuGene presso l’Università di Zurigo.
Le loro scoperte hanno importanti implicazioni non solo per la terapia basata sull’editing genetico, ma anche per l’editing genetico mediato da CRISPR su animali e piante, dove potrebbero essere innescati gli stessi tipi di danni genetici su larga scala.
Infatti, poiché tale editing viene eseguito con molta meno cautela negli organismi non umani, la probabilità che si verifichino danni su larga scala aumenta enormemente (vedere di seguito sul multiplexing).
Lo studio dimostra inoltre che i tentativi di evitare questi problemi utilizzando adattamenti delle tecnologie di editing genetico CRISPR, come l’editing di prime e di base, potrebbero non avere successo.
Questa ricerca sulla CGD è solo l’ultima di una serie di studi che hanno ripetutamente dimostrato che diversi tipi di mutazioni indesiderate derivanti dall’editing genetico possono influenzare il funzionamento di molteplici sistemi genici, con conseguenze potenzialmente dannose.
Che cosa è la CGD?
La CGD è una rara malattia ereditaria che colpisce circa una persona su 120.000. La malattia compromette la componente del sistema immunitario responsabile della lotta alle infezioni, il che può essere pericoloso per la vita del paziente.
Una variante della CGD è causata dall’assenza di due lettere nella sequenza genica dell’unità base del DNA che codifica per la proteina NCF1. Questo errore determina l’incapacità delle cellule del sangue note come neutrofili di produrre un complesso enzimatico che svolge un ruolo essenziale nella difesa immunitaria contro infezioni batteriche, da lieviti e fungine.
I risultati del nuovo studio
Nel nuovo studio, il team di ricerca è riuscito a utilizzare il sistema di editing genetico CRISPR per inserire le lettere mancanti dell’unità base del DNA nel posto giusto nel gene NCF1, riparando così il difetto genetico.
Inizialmente, hanno condotto esperimenti su colture di cellule umane contenenti il gene difettoso NCF1.
Gli autori sono poi passati agli esperimenti che utilizzano i bersagli cellulari naturali per la terapia genica CGD: cellule staminali del midollo osseo e cellule progenitrici parentali di pazienti CGD che ospitano il difetto nel gene NCF1. (Le cellule staminali del midollo osseo sono le cellule parentali da cui vengono prodotti tutti i tipi di cellule del sangue. Ciò include globuli rossi e cellule del sistema immunitario, ad esempio, cellule T, cellule B e neutrofili).
Tuttavia, alcune delle cellule riparate ora mostravano nuovi difetti genetici che interessavano ampie regioni del DNA. Intere sezioni del cromosoma attorno a dove era avvenuta la riparazione tramite editing genetico erano mancanti. Queste sezioni mancanti in alcuni casi si estendevano su milioni di unità base del DNA, con conseguente perdita di molti geni (17 in un caso).
La ragione di ciò è la particolare costellazione genetica in cui si trova il gene NCF1: è presente tre volte sullo stesso cromosoma, una volta come gene normalmente funzionante e due volte sotto forma di pseudogeni difettosi (copie imperfette del gene funzionale).
Questi pseudogeni non sono in grado di produrre la normale proteina NCF1 e quindi non possono contribuire alla formazione del complesso enzimatico richiesto dai neutrofili per combattere le infezioni.
Lo strumento di editing genetico CRISPR non è riuscito a distinguere tra le diverse versioni del gene NCF1 e quindi occasionalmente ha tagliato il filamento di DNA in più punti del cromosoma, sia nel gene NCF1 normalmente funzionante che negli pseudogeni difettosi.
Quando le sezioni sono state successivamente riunite, in alcuni casi, interi segmenti genici erano disallineati o mancanti. Le conseguenze mediche sono imprevedibili e, nel caso peggiore, possono contribuire allo sviluppo della leucemia.
«Ciò richiede cautela quando si utilizza la tecnologia CRISPR in un contesto clinico», ha affermato l’autrice principale Janine Reichenbach.
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Ricercato metodo più sicuro
Nel tentativo di ridurre al minimo i rischi di introdurre inavvertitamente danni su larga scala al DNA, il team ha testato una serie di approcci utilizzando diverse versioni dello strumento di editing genetico CRISPR.
Per prima cosa, hanno introdotto nelle cellule un complesso di editing CRISPR/Cas preassemblato, noto come RNP (ribonucleoproteina), anziché materiale genetico (plasmidi) che codifica per questo strumento di editing genetico.
L’utilizzo di complessi CRISPR/Cas RNP preassemblati è diventato uno standard nel campo della terapia genica poiché, una volta all’interno delle cellule bersaglio, hanno una vita più breve rispetto al DNA plasmidico e quindi hanno meno tempo per causare danni involontari al DNA.
I ricercatori hanno scoperto che il CRISPR/Cas RNP poteva correggere con successo il difetto genetico NCF1 nel 5% o 50% delle cellule bersaglio, a seconda del tipo di cellula. Tuttavia, ciò non ha impedito la formazione di danni al DNA su larga scala in un’alta percentuale di queste cellule bersaglio, ovvero il 25% o il 35%.
In secondo luogo, i ricercatori hanno anche testato varianti dello strumento di editing genetico CRISPR/Cas che introducono solo rotture a singolo filamento di DNA anziché la più comune rottura a doppio filamento di DNA. Questo per evitare la formazione di rotture a doppio filamento che sono generalmente considerate la causa di danni al DNA su larga scala.
Hanno anche preso in considerazione l’utilizzo di elementi protettivi che riducono la probabilità che lo strumento di editing genetico tagli il cromosoma in più siti contemporaneamente.
Sfortunatamente, nessuna di queste misure è stata in grado di prevenire completamente gli effetti indesiderati, incluso, forse sorprendentemente, il fatto che lo strumento CRISPR non abbia causato alcuna rottura del doppio filamento del DNA.
Ciò funge da avvertimento per coloro che sviluppano approcci di editing genetico basati su CRISPR che coinvolgono processi noti come prime editing e base editing, che si basano su rotture del singolo filamento di DNA per svolgere la loro attività di editing.
Si ritiene comunemente che l’utilizzo di tali metodi minimizzi il rischio di creare grandi cancellazioni e riarrangiamenti indesiderati nel DNA.
Ma la nuova ricerca dimostra che potrebbe non essere così e che è necessaria un’attenta caratterizzazione genetica molecolare, come il sequenziamento del DNA a lettura lunga, per garantire che ciò non sia accaduto.
«Questo studio evidenzia sia gli aspetti promettenti che quelli impegnativi delle terapie basate su CRISPR», ha affermato il coautore Martin Jinek, professore presso il Dipartimento di biochimica dell’Università di Zurigo.
Ha affermato che lo studio fornisce spunti preziosi per lo sviluppo di terapie di editing genetico per la CGD e altre malattie ereditarie.
«Tuttavia, sono necessari ulteriori progressi tecnologici per rendere il metodo più sicuro ed efficace in futuro».
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Implicazioni per l’editing genetico di animali e piante
Sebbene questo studio sia correlato alla terapia genica umana, ha importanti implicazioni per l’editing genetico di animali e piante. Questo perché i tipi di danni su larga scala al genoma descritti in questo studio possono verificarsi anche durante l’editing genetico di questi organismi.
Di conseguenza, il funzionamento di molti geni può essere interrotto o perso. Ciò a sua volta può portare a cambiamenti importanti nella funzione biochimica e cellulare dell’organismo.
Negli animali, gli effetti indesiderati osservati in questo studio potrebbero compromettere la salute, causando malattie come cancro e difetti dello sviluppo. Nel caso di piante alimentari geneticamente modificate, il risultato potrebbe essere una tossicità o allergenicità inaspettata, o un contenuto nutrizionale alterato.
Molti ingegneri genetici vegetali affermano di poter escludere le piante con mutazioni genetiche indesiderate. Tuttavia, a meno che una mutazione non faccia apparire la pianta palesemente malata o non riesca a crescere e propagarsi, potrebbe non essere individuata, anche se potrebbe aver dato origine a una composizione biochimica alterata che può danneggiare il consumatore.
Rischi del multiplexing
La probabilità che il danno al DNA su larga scala osservato in questo studio si verifichi durante l’editing genetico delle piante alimentari è enormemente aumentata dall’aspirazione degli ingegneri genetici vegetali di colpire più geni simultaneamente («multiplexing»).
Il multiplexing consiste nell’introdurre nelle cellule più strumenti CRISPR/Cas contemporaneamente, con l’obiettivo di colpire diverse posizioni nel DNA dell’organismo.
Ciò determina la creazione simultanea di numerosi tagli nel DNA delle cellule e di conseguenza esiste un rischio molto elevato che si verifichino grandi cancellazioni e riarrangiamenti durante la riparazione del DNA, come è dimostrato graficamente in questo studio.
È richiesto un attento esame
In conclusione, questo studio completo ha dimostrato come delezioni e riarrangiamenti su larga scala del genoma possano verificarsi in seguito all’attività anche di un singolo strumento di editing genetico CRISPR/Cas.
Si è scoperto che ciò avviene quando l’attività dello strumento di editing genetico produce una rottura del DNA a singolo o doppio filamento sia nei siti di editing previsti che in quelli non previsti. Questo processo imita anche ciò che avviene durante le applicazioni di editing genetico multiplex mediate da CRISPR/Cas.
Gli autori avvertono che i siti bersaglio dell’editing genetico devono essere esaminati attentamente per evitare che questo meccanismo provochi effetti di questo tipo.
Le persone nel campo dell’editing genetico agricolo devono assicurarsi di fare anche questo. Ma finora non abbiamo visto alcuna prova che lo stiano facendo. Questa omissione può comportare la perdita di una caratterizzazione genetica molecolare cruciale e delle conseguenze a valle di qualsiasi danno genetico in un prodotto finale modificato geneticamente e destinato al mercato.
Tali conseguenze possono includere l’interruzione di molteplici funzioni geniche, che portano a cambiamenti biochimici che risultano in tossicità o allergenicità inaspettate, o contenuto nutrizionale compromesso. Devono essere in atto delle normative per richiedere che tutte queste possibilità siano esaminate in una valutazione approfondita del rischio.
Michael Antoniou
Claire Robinson
Pubblicato originariamente da GMWatch.
Il dott. Michael Antoniou è professore di genetica molecolare presso il Dipartimento di genetica medica e molecolare del King’s College di Londra.
Claire Robinson è una redattrice di GMWatch.
I punti di vista e le opinioni espresse in questo articolo sono quelli degli autori e non riflettono necessariamente i punti di vista di Children’s Health Defense.
© 26 novembre 2024, Children’s Health Defense, Inc. Questo articolo è riprodotto e distribuito con il permesso di Children’s Health Defense, Inc. Vuoi saperne di più dalla Difesa della salute dei bambini? Iscriviti per ricevere gratuitamente notizie e aggiornamenti da Robert F. Kennedy, Jr. e la Difesa della salute dei bambini. La tua donazione ci aiuterà a supportare gli sforzi di CHD.
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